Methoden der diagnostischen Hämatologie

I Allgemeine Methoden bei hämolytischen Anämien.- 1 Osmotische Resistenz der Erythrozyten.- 1.1 Osmotische Resistenz aus frisch entnommenem Blut.- 1.1.1 Normalbereich.- 1.1.2 Bewertung und Besprechung.- 1.1.3 Hinweise und Fehlerquellen.- 1.2 Osmotische Resistenz nach 24 Stunden Inkubation.- 1.2.1 Normalbereich.- 1.2.2 Bewertung und Besprechung.- 2 Plasmahämoglobin.- 2.1 Bestimmung des Plasmahämoglobins mittels Spektralfotometer.- 2.1.1 Normalwerte: unter 1,0 mg/100 ml.- 2.1.2 Besprechung.- 2.1.3 Hinweise und Fehlerquellen.- 2.2 Weitere Methoden.- 2.2.1 Benzidinmethode.- 2.2.2 Bestimmung von freiem Hämoglobin in Heparinplasma und Serum..- 3 Heinz-Körper-Test.- 3.1 Normalwerte.- 3.2 Besprechung.- 4 Screening-Tests bei paroxysmaler nächtlicher Hämoglobinurie.- 4.1 Sucrose-Hämolyse-Test.- 4.1.1 Besprechung.- 4.2 Säure-Serum-Test (Ham-Test).- 4.2.1 Besprechung.- Literatur.- II Erythrozytenenzymdefekte als Ursache angeborener hämolytischer Anämien.- 1 Einleitung.- 2 Blutprobengewinnung, Erythrozytenreinigung.- 3 Hämolysatherstellung.- Literatur.- III Defekte der Erythrozytenmembran als Ursache angeborener hämolytischer Anamien.- 1 Einleitung.- 2 Blutprobengewinnung, Erythrozytenreinigung.- 3 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.- 4 Spektrin- und Ankyrin-Quantifizierung mittels ELISA.- 5 Strukturuntersuchung des Ankyrins.- 6 Strukturuntersuchung des Spektrins.- 7 Intraerythrozytäre Kalium- und Natrium-Konzentration.- Literatur.- IV Anämien aufgrund von Störungen der Hämoglobinsynthese und -Struktur.- 1 Einleitung.- 2 Hämoglobinelektrophorese.- 2.1 Zellulose-Azetat-Elektrophorese.- 2.2 Stärkegelelektrophorese.- 2.3 Zitrat-Agar-Gelelektrophorese.- 3 Hämoglobinstabilitäts-Tests.- 3.1 Methyl-Violett-Test.- 3.2 Brillant-Kresylblau-Test.- 3.3 Isopropanol-Test.- 3.4 Hitzestabilitäts-Test.- 4 Säulenchromatographie zur Hämoglobinanalyse.- 5 Hämoglobin F.- 5.1 Alkalidenaturierung.- 5.2 Säure-Elution.- 6 Hämoglobin A2.- 6.1 Hämoglobin A2-Messung.- 7 Hämoglobin S.- 7.1 Hämoglobin S-Löslichkeitstest.- 7.2 Sichelzelltest.- Literatur.- V Serologische Methoden für die Diagnose medikamenteninduzierter und autoimmunhämolytischer Anämien.- 1 Einleitung.- 2 Direkter Antiglobulin-(Coombs)-Test (DAT).- 3 Methoden zur Charakterisierung von Antikörpern in Serum und Eluaten.- 3.1 Enzymbehandelte Erythrozyten.- 3.2 Lösungen mit niedriger NaCl-Ionen-Konzentration (LISS).- 3.3 Herstellung von Eluaten aus Patientenerythrozyten.- 3.4 Screening-Untersuchungen für Serumantikörper.- 3.5 Spezifische Diagnosetests bei autoimmunhämolytischer Anämie.- 3.6 Medikamentös induzierte immunhämolytische Anämien.- Literatur.- VI Untersuchungen bei monoklonalen Gammopathien und immunologischen Defektzustanden.- 1 Biologische Bedeutung von monoklonalen Immunglobulinen.- 2 Nachweis von M-Gradienten in Serum und Harn.- 2.1 Probenvorbereitung.- 2.2 Proteinelektrophorese.- 2.3 Immunelektrophorese.- 2.4 Immunfixation.- 2.5 Berechnung eines monoklonalen Anteils aus quantitativen Immunglobulinbestimmungen.- 2.6 Nachweis und Differenzierung von Kryoglobulinen.- 3 Monoklonale Gammopathie unbekannter Signifikanz (MGUS).- Literatur.- VII Zytogenetische Diagnostik.- 1 Einleitung.- 2 Möglichkeiten und Perspektiven der Tumorzytogenetik.- 3 Probenmaterial.- 4 Zellkultivierung und Herstellung der Chromosomenpräparate.- 4.1 Direktpräparation der Chromosomen.- 4.2 Kurzzeitkultivierung verschiedener Gewebe und zytogenetische Preparation.- 4.3 Langzeitkultivierung.- 4.4 Chromosomenfärbungen.- 4.4.1 Giemsa-Bandenfärbung mit 2X SSC-Vorbehandlung (GAG).- 4.4.2 Fluoreszenz-Bandenfärbung mit Quinacrin-Mustard (QFQ).- 4.4.3 C-Bandenfärbung mit Barium-Hydroxyd-Vorbehandlungen (CBG).- 4.4.4 Silberfärbung der aktiven Nukleolus-Organisation-Regionen an akrozentrischen Chromosomen (= Ag-NOR-Färbung).- 5 Auswertung.- 6 Zytogenetische Terminologie.- 7 Chromosomenanomalien und ihre Bezeichnung.- 7.1 Numerische Chromosomenanomalien.- 7.2 Strukturelle Chromosomenanomalien.- Literatur.- VIII Interphasenzytogenetik mittels Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH).- 1 Einleitung.- 2 Methodik.- 3 Anwendungen von FISH und Ausblick.- Literatur.- IX Zytochemische Methoden.- 1 Einleitung.- 2 Substanznachweismethoden.- 2.1 Eisen (Berliner Blau-Reaktion).- 2.2 PAS (Periodic Acid-Schiff)-Reaktion.- 2.3 Metachromasie-Nachweis mit Toluidinblau.- 2.4 Sudan-Schwarz-B-Färbung.- 3 Enzymnachweismethoden.- 3.1 Peroxidase-Reaktion (POX).- 3.2 Hydrolasen.- 3.2.1 Alkalische Phosphatase.- 3.2.2 Saure Phosphatase-Reaktion (SPh).- 3.2.3 Esterasenachweis mit Naphtylacetat oder Naphtylbutyrat („neutrale Esterase“).- 3.2.4 Saure Esterase-Reaktion (SEst).- 3.2.5 Chloracetat-Esterase.- 3.2.6 Dipeptidylaminopeptidase IV (DAP IV)-Methode.- 3.3 TDT (Terminale Deoxynucleotidyltransferase) Immunfluoreszenztechnik.- 4 Anhang.- 4.1 Fixierung (geeignet für: Esterase, saure Phosphatase, DAP IV).- 4.2 Natriumnitritlösung, 4%.- 4.3 Pararosanilinlösung, 4%.- X Immunzytologie und Knochenmarkimmunhistologie.- 1 Einleitung.- 2 Präparationsmethoden.- 2.1 Untersuchungsmaterial.- 2.1.1 Knochenmark.- 2.1.2 Zytopräparate.- 2.2 Färbungen.- 3 Diagnostik immunhistologischer Knochenmarkbiopsien.- 3.1 Zellularität.- 3.2 Verteilung der hämatopoetischen Zellen im normalen Knochenmark..- 3.3 Infiltrationsmuster.- 3.4 Fibrose und Sklerose.- 3.5 Reaktionsmuster mit applizierten Antikörpern.- 4 Anwendungsgebiete.- 4.1 Lymphome.- 4.2 Therapiemonitoring am Beispiel der Haarzelleukämie.- 4.3 Akute Leukämie.- 4.4 Seltene Indikationen.- 5 Ausblick.- Literatur.- XI Durchflußzytometrie.- 1 Einleitung.- 2 Aufbau des Durchflußzytometers.- 2.1 Probenzuführung.- 2.2 Messung der Lichtstreuung.- 2.3 Messung der Fluoreszenz.- 2.4 Signalverarbeitung und Messung.- 3 Praparationsmethoden.- 3.1 Peripheres Blut/Knochenmarkaspirat (PB/KMA).- 3.2 Untersuchung von Bronchiallavagen, Punktaten und Lymphknoten...- 3.3 Oberflächentest.- 3.3.1 Oberflächenfarbung mit direkt markierten Antikörpern.- 3.3.2 Arbeit mit indirekten Antikörpern.- 3.4 Fixierung und Einfrieren von Proben.- 3.5 Nukleäre Antigene.- 3.5.1 Ki67.- 3.5.2 Terminale Deoxynucleotidyl Transferase (TdT).- 3.6 Intrazelluläre Antigene am Beispiel der Myeloperoxidase (MPO).- 3.7 Messung des DNA Gehalts.- 3.7.1 Durchflußzytometrische Beurteilung der DNA.- 3.7.2 Preparation von Zellen zur DNA Bestimmung.- 3.7.3 DNA-Messung.- 3.8 Messung des Rhodamin Effluxes (MDR).- 3.9 Respiratory Burst/Phagozytenaktivitat.- 3.10 Andere Präparationsmethoden.- 4 Analyse.- 4.1 Charakterisierung des normalen Knochemarks.- 4.1.1 Erythroide Reihe.- 4.1.2 Lymphoide Zellen.- 4.1.3 Myelomonozytäre Linie.- 4.2 Durchflußzytometrische Charakterisierung des peripheren Blutes.- 4.3 Pathologische Veranderungen.- 4.3.1 Leukämien.- 4.3.2 Lymphome.- 4.3.3 Myeloproliferative Erkrankungen.- 4.3.4 AIDS-Monitoring.- Literatur.- XII In situ-Hybridisierung.- 1 Einleitung.- 2 Arbeitsgrundlagen.- 3 Wahl der Probe.- 3.1 DNA- und RNA-Sonden.- 3.2 Radioaktive Nachweismöglichkeiten für DNA und RNA.- 3.3 Nicht-radioaktive Proben.- 3.4 Labeling der Proben.- 3.5 Determination der Probengröße und der Reinigung der Proben.- 3.6 Einfluß der Probenlänge auf die Hybridisierungseffizienz.- 4 Detektionssysteme für nicht radioaktive Methoden.- 5 Preparation der Objekttrager.- 5.1 Anmerkungen.- 6 Zellgewinnung von Zytopräparaten und Schnitten.- 6.1 Zell- und Gewebsaufbereitung von Blut bzw. Knochenmark.- 6.2 Präparatherstellung.- 6.2.1 Zytopsin von Zellsuspensionen.- 7 Permeabilisierung der Zellen.- 8 Prähybridisierung (RNA-Nachweis).- 9 Denaturierung der Target DNA bei DNA/DNA in situ Hybridisierungen.- 10 Hybridisierung.- 10.1 Anmerkungen.- 11 Posthybridisierung.- 11.1 Waschen der Präparate.- 11.2 RNAse-Nachverdau.- 11.3 Dehydrieren.- 11.4 Befilmen.- 11.5 Exposition.- 11.6 Entwicklung.- 11.7 Gegenfärbung.- 11.8 Eindecken.- 12 Spezifitätskontrollen.- 13 Quantitative Analytik (semiquantitativ versus automatisiert).- Literatur.- XIII Molekularbiologie in der medizinischen Diagnostik.- 1 Einleitung.- 2 Allgemeine Grundlagen der Molekularbiologie.- 2.1 Chemischer Aufbau der Nukleinsäuren.- 2.2 Basenpaarung und Komplementarität.- 2.3 Spaltbarkeit der Nukleinsäuren.- 2.4 Aufbau der Gene.- 3 Untersuchung von Nukleinsäuren.- 3.1 Isolierung der Nukleinsäuren.- 3.1.1 DNA Isolierung.- 3.1.2 RNA Isolierung.- 3.2 Ausbeutebestimmung und analytische Überprüfung der Nukleinsauren.- 3.2.1 Messung der optischen Dichte.- 3.2.2 Gelelektrophoresen.- 3.3 Blotverfahren.- 3.3.1 Dot oder Slot Blot.- 3.3.2 Southern Blot.- 3.3.3 Northern Blot.- 3.4 Hybridisierungsverfahren.- 3.4.1 Markierung von Gensonden.- 3.4.2 Durchführung von Hybridisierungen.- 3.5 Polymerasekettenreaktion (PCR).- 3.5.1 Prinzip der PCR.- 3.5.2 Durchführung einer PCR.- 3.5.3 PCR Amplifikation von RNA nach reverser Transkription (RT-PCR)..- 4 Diagnostische Anwendungsmöglichkeiten.- 4.1 Anwendung des Southern Blots.- 4.1.1 Erkennung von Punktmutationen.- 4.1.2 Nachweis von DNA Polymorphismen.- 4.1.3 Untersuchung von Translokationen und Rearrangements.- 4.2 Anwendungsbeispiele der PCR.- 4.2.1 Identifikation von Mutationen.- 4.2.2 Detektion von Translokationen.- 4.2.3 Amplifikation hochvariabler Regionen in humanen Genen.- 4.2.4 Amplifikationen von DNA in intakten Zellen.- Literatur.- XIV Methoden zum Nachweis und Monitoring einer HIV-Infektion.- 1 Einleitung.- 2 Primäre Untersuchungen zur Feststellung der Seropositivität.- 2.1 Herstellung der Antigene.- 2.2 HIV ELISA.- 2.3 Bestätigungstestverfahren.- 2.3.1 HIV-Westernblot.- 2.3.2 Immunfluoreszenz.- 2.3.3 Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA).- 3 Immunologisches Monitoring bei HIV-Infektion.- 3.1 p24 Antigentest.- 3.2 Neopterin.- 4 Methoden zum direkten Virusnachweis.- 4.1 Viruskultur.- 4.2 Polymerase chain reaction (PCR).- Literatur.