La NAD(P)H quinona oxidorreductasa humana (hNQO1) es un importante biomarcador relacionado con el cáncer, que muestra una sobreexpresión significativa en las células malignas. El desarrollo de un método eficaz para detectar la actividad de la NQO1 con alta sensibilidad y selectividad en los tumores tiene un gran potencial para el diagnóstico, el tratamiento y la gestión del cáncer. En el presente estudio, presentamos una nueva sonda fluorescente basada en la dicianoisoforona (DCP) (NQ-DCP) capaz de monitorizar la actividad de la hNQO1 in vitro e in vivo tanto en el modelo ratiométrico como en el de activación. La NQ-DCP se preparó conjugando la fluorosonda de dicianoisóforo con el ácido quinona propiónico (QPA) activable por la hNQO1, que permanece no fluorescente hasta su activación por la hNQO1 específica del tumor. El NQ-DCP presentaba un gran desplazamiento de Stokes (145 nm), una excelente biocompatibilidad, permeabilidad celular y selectividad hacia la hNQO1 que permitía diferenciar las células cancerosas de las sanas. Hemos empleado con éxito el NQ-DCP para monitorizar de forma no invasiva la actividad endógena de la hNQO1 en células tumorales cerebrales in vitro y en tumores xenografiados desarrollados en ratones desnudos.