Molekularbiologische Methoden: Uni-Taschenbücher, cartea 8449
Autor Thomas Reinardde Limba Germană Paperback – noi 2010
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Specificații
ISBN-13: 9783825284497
ISBN-10: 3825284492
Pagini: 220
Ilustrații: 127 Abbildungen, 41 Tabellen, 15 Maps
Dimensiuni: 174 x 243 x 20 mm
Greutate: 0.68 kg
Editura: UTB GmbH
Seria Uni-Taschenbücher
ISBN-10: 3825284492
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Cuprins
Inhaltsverzeichnis 1. Das Leben und seine Bestandteile 12 1.1. Der Aufbau von DNA und RNA 13 1.2. Der genetische Code 15 1.3. Die Gene 16 1.3.1. Die Genstruktur in Prokaryonten 18 1.3.2. Genstruktur in Eukaryonten 19 1.4. Die Proteine 21 1.5. Die Zelle 23 2. Grundlagen der Arbeit im Labor 25 2.1. Wasser 25 2.2. Messung des pH-Wertes 26 2.3. Puffer 27 2.4. Waagen 28 2.5. Mikropipetten 29 2.6. Gefäße im Labor 30 2.7. Zentrifugen 30 2.8. Mischen und Konzentrieren 33 2.9. Konzentrieren 33 2.10. Pufferwechsel 34 2.11. Proben-Lagerung 34 2.12. Steriles Arbeiten 35 2.13. Die kleinen Freunde - Pflege und Aufzucht von Escherichia coli 37 2.13.1. Nährmedien 38 2.13.2. Antibiotika 40 2.13.3. Lagerung von Bakterien 42 2.14. Der Aufschluss von Geweben 43 3. Aufreinigung von Nukleinsäuren 46 3.1. Gegenspieler erfolgreicher DNA- und RNA-Isolationen 46 3.1.1. Nukleasen 47 3.1.2. Scherkräfte 48 3.1.3. Chemische Verunreinigungen 48 3.1.4. EDTA und zweiwertige Ionen: das Yin und Yang der Molekularbiologie 49 3.2. Extraktion von Nukleinsäuren 49 3.2.1. Der Extraktionspuffer 49 3.3. Die weitere Aufreinigung der DNA 51 3.3.1. Phenolextraktion 52 3.3.2. Ethanolfällung 53 3.3.3. Isopropanolfällung 55 3.3.4. PEG Fällung 55 3.3.5. Entfernen von Polysacchariden mit CTAB 55 3.3.6. Silikamatrices 56 3.3.7. Tropfendialyse 57 3.4. Einige ausgewählte DNA-Aufreinigungsmethoden 57 3.4.1. Die Plasmidpräparation aus E. coli 57 3.4.2. Die Isolation von DNA aus Pflanzen mit CTAB 59 3.4.3. Isolation von DNA aus Blut oder Zellkulturen 60 3.4.4. Isolation hochmolekularer DNA 61 3.5. Die Isolation von RNA 61 3.6. Übersicht über den Einsatz von Kits 64 3.7. Tipps zum Erzielen hoher Ausbeuten bei der Isolation von Nukleinsäuren 64 3.8. Quantifizierung von Nukleinsäuren 66 3.8.1. DNA-Bestimmung im Photometer 66 3.8.2. Konzentrationsbestimmung mittels optischer Dichte 68 4. Polymerase Kettenreaktion 70 4.1. Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion 71 4.2. Die Komponenten der PCR 71 4.2.1. Die Ausgangs-DNA 72 4.2.2. Thermostabile DNA-Polymerasen 73 4.2.3. Puffer, Magnesium und dNTPs 75 4.2.4. Primerdesign 76 4.3. Geräte für die PCR 80 4.4. Die Standard-PCR 81 4.5. Ausgewählte PCR-Methoden 82 4.5.1. Gradienten-PCR und inkrementelle PCR 82 4.5.2. Nested PCR 83 4.5.3. Multiplex PCR 83 4.5.4. Einführen von Restriktionsschnittstellen 84 4.5.5. Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) 85 4.5.6. Kolonie-PCR 87 4.5.7. Quantitative PCR 88 4.6. Anwendungen der PCR 89 4.7. Optimierung der PCR-Reaktion 90 4.7.1. Optimierung der PCR-Effizienz 90 4.7.2. Optimierung der Genauigkeit und Spezifität der PCR 91 5. Klonieren für Einsteiger 93 5.1. Restriktionsenzyme 94 5.1.1. Restriktionsenzyme des Typs II-RM 95 5.1.2. Restriktionsenzyme im Labor 98 5.1.3. Methylasen 99 5.2. Ligation 100 5.3. Dephosphorylierung 102 5.4. Die Transformation von E. coli 103 5.5. Der Weg zum klonierten Gen 106 5.6. Der ungerichtete Einbau einer amplifizierten DNA in einen Vektor 106 5.6.1. Die Klonierung über eine Restriktionsstelle 107 5.6.2. TA-Klonierung 107 5.6.3. Klonieren eines PCR-Amplifikats in den Vektor pCRScript 108 5.6.4. Klonieren eines PCR-Amplifikats in einen Suicide-Vektor 108 5.7. Der gerichtete Einbau von DNA in einen Vektor 109 5.7.1. Der weitere Ablauf der Klonierung 110 5.8. Ligase-unabhängige Klonierungssysteme 110 5.8.1. DNA Polymerase-basierte Klonierungssysteme 111 5.8.2. Topoisomerase-basierte Klonierung 111 5.9. Und wenn es mal nicht klappt... 112 6. Vektoren 114 6.1. Plasmide 114 6.2. Klonierungsplasmide 117 6.2.1. Blau-Weiß-Screening 118 6.2.2. Suicide Vektoren 120 6.3. Rekombinase-basierte Klonierung 121 6.4. Expressionsplasmide 123 6.4.1. Promotoren für Expressionsvektoren 123 6.4.2. Weitere regulative Sequenzen 125 6.4.3. Expression in das Periplasma 125 6.4.4. Einschlusskörperchen (Inclusion Bodies) 126 6.4.5. Tag-Sequenzen 126 6.5. Reportergene 127 6.6. Phagen 130 6.7. Phagemide 131 6.8. Shuttle Vektoren 132 6.9. Künstliche Chromosomen: BACs, PACs und YACs 133 6.9.1. BACs - Bacterial Arti?cial Chromosome 133 6.9.2. PAC-Vektoren 134 6.10. Hefen als Klonierungs- und Expressionssystem 134 6.11. Die Transformation von Pflanzen 136 6.12. Die Transformation von Säugetieren und tierischen Zellkulturen 138 6.12.1. Säugetiere als Modellorganismen 138 6.12.2. Säuger-Zellkulturen 139 6.12.3. Vektoren für tierische Zellen 140 7. Elektrophorese von Nukleinsäuren 142 7.1. Agarose-Gelelektrophorese von DNA 142 7.2. Die Detektion der DNA im Gel 145 7.3. Präparative Agarosegele 147 7.4. Auftrennen von RNA im Agarosegel 148 7.5. Fehlersuche bei Agarose-Gelelektrophorese 149 8. Proteinaufreinigung 151 8.1. Homogenisation 152 8.1.1. Proteasen 153 8.1.2. Phenoloxidasen 155 8.2. Extraktion von Proteinen 156 8.2.1. Homogenisationspuffer 156 8.2.2. Abtrennen von Zell- und Gewebetrümmern 157 8.2.3. Fraktionierung des Rohextraktes 157 8.3. Dialyse und Konzentrierung 159 8.4. Weitere Aufreinigungsschritte 161 8.4.1. Chromatographie 161 8.4.2. Chromatographische Trennprinzipien 162 8.4.3. Magnetic Beads 163 8.5. Quantifizierung von Proteinen 164 8.5.1. Proteinbestimmung nach Bradford 164 8.5.2. Der BCA Test 166 8.5.3. Welchen Test benutzen? 166 8.6. Aufreinigungsverfahren für getaggte Proteine aus E. coli 166 8.6.1. Bakterienanzucht und Homogenisation 167 8.6.2. Weitere Aufreinigung des heterologen Proteins 169 9. Gelelektrophorese von Proteinen 171 9.1. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) 172 9.2. Die denaturierende SDS-PAGE 172 9.2.1. Herstellung eines Proteinextraktes für die SDS-Gelelektrophorese 172 9.2.2. Herstellen des Gels 174 9.2.3. Der Gellauf 177 9.3. Das Färben der Gele 178 9.4. Weitere Elektrophoreseverfahren für Proteine 180 9.4.1. Native PAGE 181 9.4.2. Blue Native PAGE 181 9.4.3. Isoelektrische Fokussierung 181 9.4.4. 2-D-Gelelektrophorese 182 9.5. Western Blotting 183 9.6. Wenn es mal nicht klappt 185 10. Immunbiochemische Methoden 187 10.1. Antikörper 188 10.2. Prinzipien immunbiochemischer Verfahren 191 10.2.1. Immunpräzipitation 191 10.2.2. Trägerbasierte Immunfärbung 192 10.2.3. Immobilisierung des Antigens 193 10.2.4. Blocken überschüssiger Bindestellen 193 10.2.5. Detektion der Bindung 194 10.2.6. Bindung der Antikörper-Kaskade 196 10.3. Spezifische und unspezifische Bindungen 197 10.4. Immunbiochemische Verfahren 198 10.5. ELISA 198 10.5.1. Sandwich ELISA 201 10.5.2. Kompetitiver ELISA 202 10.6. Immunfärbung nach Western Blot 203 10.7. Immunoaffinitätschromatographie 204 10.8. Weitere antikörperbasierte Methoden 206 10.8.1. Lokalisation des Antigens in einem Gewebe oder in einer Zelle 206 10.8.2. Markierung von Zellen 207 10.9. Und wenn es nicht klappt? 207 11. Molekularbiologie für Fortgeschrittene 208 11.1. DNA-Sequenzierung 208 11.1.1. Sequenzierung nach Sanger 208 11.1.2. Herstellen von Proben für die DNA-Sequenzierung 210 11.1.3. Analyse der Daten der DNA-Sequenzierung 211 11.2. Bioinformatische Sequenzanalyse 211 11.3. Der Einsatz der Bioinformatik für die Klonierung von DNA 213 11.4. Vollständige Sequenzen durch 3\' RACE-PCR und 5\' RACE-PCR 215 11.5. Stammsammlungen 216 11.6. Identifizierung von Nukleinsäuren durch Hybridisierung 217 11.6.1. Herstellung der Sonde 217 11.6.2. Hybridisierung 218 11.7. DNA-Chips oder Microarrays 219 11.8. Veränderung von Nukleinsäuren 220 11.9. Synthetische Gene 224
Notă biografică
Dr. Thomas Reinard lehrt an der Leibniz Universität Hannover.